• Diagnóstico de las enfermedades mitocondriales

    Las enfermedades mitocondriales son un grupo heterogéneo de trastornos, secundarios a un defecto en el metabolismo energético debido a una disfunción genéticamente determinada del sistema de fosforilación oxidativa.



    Aunque el diagnóstico generalmente es sospechado por las manifestaciones clínicas del cuadro, son necesarias evaluaciones bioquímicas y moleculares para alcanzar un diagnóstico específico.

    Las enfermedades mitocondriales pueden seguir un patrón de herencia mendeliano (recesivo, dominante o ligado a X) o bien una forma de herencia materna. La mayoría de las que se inician en la edad pediátrica son secundarias a mutaciones en genes nucleares y de herencia recesiva.



    Información continuamente actualizada sobre métodos diagnósticos en las enfermedades mitocondriales puede encontrarse en www.mitosoc.org.



    En algunos casos el conjunto de los síntomas permite sospechar un cuadro clínico concreto y realizar el estudio genético dirigido para confirmar el diagnóstico. Sin embargo, en la mayoría de los casos, especialmente en la infancia, únicamente el conjunto de síntomas con afectación de varios órganos y sistemas, asociado a aumento del ácido láctico, permite sospechar una enfermedad mitocondrial subyacente. En este caso, se hacen necesarios estudios morfológicos, histoquímicos y bioquímicos, además de los moleculares, para orientar el diagnóstico (Mitochondrial Medicine Society's Committee on Diagnosis, 2008).

     

    Estudios de Laboratorio

    El aumento del ácido láctico en sangre y/o LCR es un marcador importante, aunque no específico de enfermedad mitocondrial. Sin embargo, los pacientes pueden presentar niveles basales normales de ácido láctico e incrementarse únicamente en caso de crisis metabólica o tras el ejercicio. Otros trastornos mitocondriales no se acompañan de aumento de sus niveles; así en los relacionados con mutaciones en POLG, en la neuropatía óptica de Leber, síndrome de Kearn-Sayre o en casos de déficit de complejo I.

    La caída en la relación NAD/NADH secundaria a disfunción de la cadena respiratoria mitocondrial se traduce en un aumento de la relación lactato:piruvato en el rango 50 a 250:1, siendo normal una relación <25:1.

    La enzima creatin quinasa (CPK) suele ser normal o estar mínimamente aumentada en las enfermedades secundarias a alteración del ADNmt, salvo en las miopatías por depleción del mismo.

    Finalmente, los niveles de ácido fólico están disminuidos en el LCR en el Síndrome de Kearn-Sayre, lo que justifica su administración en estos casos.

     

    Neurorradiología

    Los hallazgos de neurorradiología apoyan en muchos casos el diagnóstico de sospecha de enfermedad mitocondrial, presentando generalmente signos inespecíficos como leucoencefalopatía (cambios de señal en sustancia blanca en secuencias de TR largo y FLAIR), calcificaciones de ganglios de la base, etc. En el caso del síndrome de Leigh los hallazgos son bastante específicos, en forma de lesiones necróticas bilaterales y simétricas en ganglios de la base (hiperintensidad de señal en putamen, núcleo caudado y globo pálido). En el MELAS, por otro lado, pueden observarse lesiones ictus-like en regiones parieto-occipitales que no siguen ningún territorio vascular definido y que al contrario que los ictus no brillan en las secuencias de difusión.

    Finalmente, la espectroscopía por resonancia magnética puede revelar un incremento de ácido láctico en el LCR y en regiones específicas del cerebro. Los niveles de lactato se comparan con los de NAA (N-acetil-aspartato), un buen indicador de la viabilidad celular.

     

    Biopsia muscular

    Es una de las principales herramientas para el diagnóstico de enfermedad mitocondrial puesto que permite el análisis morfológico e histoquímico del tejido, el análisis bioquímico de la actividad de los complejos enzimáticos de la cadena respiratoria y el análisis molecular.

    HISTOQUÍMICA.

    Una de las consecuencias de las mutaciones en el ADNmt es la proliferación de las mitocondrias, que es visible mediante la tinción con tricrómico de Gomori modificada en el microscopio óptico (las fibras donde existe proliferación se tiñen intensamente de rojo y se conocen como fibras rojo rasgadas - FRR). Una técnica más sensible sin embargo es la tinción con Succinato Deshidrogenasa (SDH), puesto que ésta es una enzima de la cadena respiratoria codificada por el ADNn. En este caso las mitocondrias se tiñen intensamente de azul.

    La existencia de FRR refleja un intento de compensación del defecto metabólico subyacente mediante una proliferación mitocondrial pero su presencia no es imprescindible ni patognomónica de enfermedad mitocondrial. En los niños pueden no estar presentes las FRR y al contrario, pueden ser un hallazgo normal en el músculo de adultos sanos mayores de 50 años. Por ello en la interpretación de la biopsia es imprescindible tener en cuenta la edad del individuo y el contexto clínico. Ejemplos de ausencia de FFR en enfermedades debidas a mutaciones en ADNmt son el NARP (neuropatía, ataxia y retinitis pigmentosa; secundario a mutaciones en el gen ATPasa 6) y pacientes con neuropatía óptica de Leber con mutaciones en los genes ND.

    La tinción con citocromo c oxidasa (COX) tiene especial interés en el diagnóstico de enfermedades mitocondriales secundarias a defectos del ADNmt puesto que las tres subunidades catalíticas de esta enzima (COX I a III) están codificadas por el ADNmt. Así, la presencia de fibras COX negativas (coincidentes o no con fibras rojo rotas) sugiere afectación de la síntesis intramitocondrial de proteínas, como ocurre en las deleciones del ADNmt y en las mutaciones puntuales en genes codificantes de ARNs de transferencia.

    Los pacientes con defectos del complejo I o III tienen fibras rojo rotas COX positivas mientras que los pacientes con defectos del complejo IV tienen fibras rojo rasgadas COX negativas, junto con otras fibras también COX negativas aunque no tengan proliferación mitocondrial.

     

    Análisis de la actividad de las enzimas de la cadena respiratoria

    Consiste en la confirmación de la deficiencia en alguno de los complejos multienzimáticos que constituyen la cadena respiratoria mediante la aplicación de una serie de ensayos enzimáticos. Estos ensayos se pueden realizar mediante estudios polarográficos o espectrofotométricos, que miden el consumo de oxígeno o las actividades de las enzimas respiratorias por separado. En el primer caso, el consumo de oxígeno se determina en fracciones enriquecidas en mitocondrias obtenidas de biopsias musculares utilizando un electrodo de oxígeno conocido como electrodo de Clark. Este método precisa la utilización de material fresco, no congelado previamente, lo que dificulta su aplicación. Los análisis espectofotométricos pueden realizarse en homogenados de tejidos que puede haberse mantenido congelado con anterioridad.



    Déficits combinados de múltiples complejos enzimáticos suelen asociarse con defectos en el ADNmt que afecta a la síntesis intramitocondrial de proteínas (por ejemplo mutaciones en genes codificantes de ARNs de transferencia o grandes deleciones del ADNmt).



    Defectos aislados de algún complejo de la cadena sugiere bien un defecto del ADNn o bien una mutación en algún gen del ADNmt que codifique para alguna subunidad del complejo.



    El defecto combinado de los complejos II+III cuando se analizan juntos, con actividad normal de ambos analizados por separado, debe hacer sospechar un déficit de coenzima Q10 (esto se debe a que la actividad combinada de estos complejos requiere de la presencia de CoQ10, no siendo así su actividad por separado).



    Siempre que se sospeche enfermedad mitocondrial debe estudiarse la actividad de los complejos aunque la biopsia muscular sea normal, sobre todo en los niños (donde la presencia de fibras rojo rasgadas es más rara).



    Genética molecular (Di Mauro, 2009; Finsterer J, 2009 ; Tucker, 2010)

    En aquellos pacientes que presentan un cuadro clínico definido, tipo MELAS, MERFF, NARP o KSS, se estudian directamente las mutaciones más frecuentemente relacionadas con estos síndromes. Por ejemplo, en caso del MELAS se estudiará en primer lugar la presencia de la mutación A3243G, que es responsable del 80% de los casos típicos. Solo cuando esta es negativa se extiende el estudio a mutaciones menos frecuentes. Sin embargo, debe saberse que el nivel de la mutación m.3243A>G en sangre disminuye con la edad y pudiendo llegar a ser indetectable por encima de los 30 años. Al contrario, suelen permanecer constantes en orina por lo que ésta debe ser analizada además de la sangre.



    Generalmente la sangre es una muestra adecuada para el estudio de mutaciones puntuales en genes que codifican para ARNt (como en MELAS y MERFF), mutaciones de herencia materna en genes que codifican para proteínas (NARP/MILS, LHON), y deleciones únicas en KSS y Síndrome de Pearson. Sin embargo, es imprescindible estudiar el músculo para detectar deleciones únicas en casos esporádicos con oftalmoplejia externa progresiva, mutaciones puntuales en familiares oligo o asintomáticos de enfermos con MELAS y muchas mutaciones puntuales en genes que codifican para proteínas.



    En aquellos casos donde se detecte la presencia de deleciones múltiples en el ADNmt (por RFLP, Southern-blot o long-PCR) debe sospecharse enfermedades que afecten a la comunicación intergenómica y secuenciar: POLG1 (PEO – oftalmoplejia externa progresiva - autosómica dominante o recesiva, SANDO – neuropatía sensorial atáxica, disartria y oftalmoplejia - ), POLG2, PEO1 (PEO autosómica dominante), ANT1 (PEO autosómica dominante), TYMP (MNGIE – encefalomiopatía neurogastrointestinal -) o OPA1 (ADOAD – atrofia óptica autosómica dominante - ). La secuenciación debe comenzar por POLG1 dado que es el que más frecuentemente presenta mutaciones. TYMP debe estudiarse únicamente si los niveles de timidina en sangre están aumentados.



    Si el fenotipo sugiere síndrome de Leigh el estudio se dirigirá hacia los genes nucleares que codifican para subunidades de la cadena respiratoria o bien factores de ensamblaje; SURF1, ATP12, SCO1, SCO2, COX10, COX15, NDUFS, NDUFV, SDH.



    Si el individuo se presenta con un fenotipo no sindrómico, los estudios bioquímicos de la cadena respiratoria permiten dirigir en parte el estudio molecular. Así, si únicamente existe un defecto aislado de la actividad de un complejo, se estudiarán aquellos genes que codifican para las subunidades del complejo afecto o bien sus factores de ensamblaje. Si se detecta déficit combinado de varios complejos de la CR deberá descartarse la existencia de un síndrome de depleción del ADNmt (disminución del número de copias de ADNmt). En caso de confirmarse su existencia, el estudio se dirigirá hacia genes que puedan ser responsables de este defecto; TK2 o RRM2B en caso de afectación muscular predominante, SUCLG1, SUCLA2 si coexiste afectación cerebral y muscular y POLG1, PEO1,DGUOK o MPV17 en caso de afectación hepática predominante.



    En caso de no existir depleción del ADNmt y confirmarse la existencia de un déficit combinado de la actividad de los complejos, deberán secuenciarse genes implicados en la síntesis intramitocondrial de proteínas: PUS1, EFT, EFG1, EFTs, MRPS16, MRPS22, RARS2, DARS2.



    Finalmente, aunque el paciente no presente un fenotipo encuadrable en un síndrome típico, algunas de las características clínicas acompañantes pueden orientar hacia qué genes estudiar en primer lugar; de esta manera, cardiomiopatías aisladas se han asociado a un grupo de mutaciones en genes tRNALeu o tRNAIle, la sordera no sindrómica con mutaciones en el gen tRNASer y la presencia de lipomas múltiples con tRNALys.

    Aunque la mayor parte de los pacientes adultos con enfermedad mitocondrial tienen mutaciones en el ADNmt, cada vez se conocen más genes nucleares cuya alteración produce una disfunción secundaria de la cadena respiratoria y como consecuencia enfermedad mitocondrial. Hasta la fecha, la mayoría de los genes nucleares identificados causan enfermedades graves de presentación en la infancia o adolescencia temprana. Sin embargo es importante el descubrimiento reciente de que mutaciones en POLG pueden producir enfermedad mitocondrial de presentación en la edad adulta, por lo que su estudio debe ser considerado pronto en el diagnóstico diferencial, sobre todo en los casos donde existan deleciones múltiples del ADNmt.

     

    BIBLIOGRAFÍA

     DiMauro S, Hirano M. Pathogenesis and treatment of mitochondrial disorders. Adv.Exp.Med.Biol. 2009;652:139-170.

     Finsterer J, Harbo HF, Baets J, Van Broeckhoven C, Di Donato S, Fontaine B, et al. EFNS guidelines on the molecular diagnosis of mitochondrial disorders. Eur.J.Neurol. 2009 Dec;16(12):1255-1264.

     Mitochondrial Medicine Society's Committee on Diagnosis, Haas RH, Parikh S, Falk MJ, Saneto RP, Wolf NI, et al. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol.Genet.Metab. 2008 May;94(1):16-37.

     Tucker EJ, Compton AG, Thorburn DR. Recent advances in the genetics of mitochondrial encephalopathies. Curr.Neurol.Neurosci.Rep. 2010 Jul;10(4):277-285.